berita

Dalam dekade terakhir, teknologi pengurutan gen telah banyak digunakan dalam penelitian dan praktik klinis kanker, menjadi alat penting untuk mengungkap karakteristik molekuler kanker. Kemajuan dalam diagnosis molekuler dan terapi tertarget telah mendorong pengembangan konsep terapi presisi tumor dan membawa perubahan besar pada seluruh bidang diagnosis dan pengobatan tumor. Pengujian genetik dapat digunakan untuk memperingatkan risiko kanker, memandu keputusan pengobatan dan mengevaluasi prognosis, serta merupakan alat penting untuk meningkatkan luaran klinis pasien. Di sini, kami merangkum artikel-artikel terbaru yang diterbitkan di CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol, dan jurnal lainnya untuk meninjau penerapan pengujian genetik dalam diagnosis dan pengobatan kanker.

Mutasi somatik dan mutasi germline. Secara umum, kanker disebabkan oleh mutasi DNA yang dapat diwariskan dari orang tua (mutasi germline) atau didapat seiring bertambahnya usia (mutasi somatik). Mutasi germline sudah ada sejak lahir, dan mutatornya biasanya membawa mutasi tersebut pada DNA setiap sel dalam tubuh dan dapat diwariskan kepada keturunannya. Mutasi somatik diperoleh oleh individu dalam sel non-gametik dan biasanya tidak diwariskan kepada keturunannya. Baik mutasi germline maupun somatik dapat merusak aktivitas fungsional normal sel dan menyebabkan transformasi sel menjadi ganas. Mutasi somatik merupakan pendorong utama keganasan dan biomarker paling prediktif dalam onkologi; namun, sekitar 10 hingga 20 persen pasien tumor membawa mutasi germline yang secara signifikan meningkatkan risiko kanker mereka, dan beberapa mutasi ini juga bersifat terapeutik.
Mutasi penggerak dan mutasi penumpang. Tidak semua varian DNA memengaruhi fungsi sel; rata-rata, dibutuhkan lima hingga sepuluh peristiwa genomik, yang dikenal sebagai "mutasi penggerak", untuk memicu degenerasi sel normal. Mutasi penggerak sering terjadi pada gen yang berkaitan erat dengan aktivitas kehidupan sel, seperti gen yang terlibat dalam regulasi pertumbuhan sel, perbaikan DNA, pengendalian siklus sel, dan proses kehidupan lainnya, serta berpotensi digunakan sebagai target terapi. Namun, jumlah total mutasi pada setiap kanker cukup besar, berkisar dari beberapa ribu pada beberapa kanker payudara hingga lebih dari 100.000 pada beberapa kanker kolorektal dan endometrium yang sangat bervariasi. Sebagian besar mutasi tidak memiliki signifikansi biologis atau terbatas, bahkan jika mutasi terjadi pada daerah pengkode, peristiwa mutasi yang tidak signifikan tersebut disebut "mutasi penumpang". Jika varian gen pada jenis tumor tertentu memprediksi respons atau resistensinya terhadap pengobatan, varian tersebut dianggap dapat dioperasi secara klinis.
Onkogen dan gen penekan tumor. Gen yang sering bermutasi pada kanker secara garis besar dapat dibagi menjadi dua kategori, onkogen dan gen penekan tumor. Pada sel normal, protein yang dikode oleh onkogen berperan utama dalam mendorong proliferasi sel dan menghambat apoptosis sel, sementara protein yang dikode oleh gen onkosupresor berperan utama dalam mengatur pembelahan sel secara negatif untuk mempertahankan fungsi sel normal. Dalam proses transformasi maligna, mutasi genom menyebabkan peningkatan aktivitas onkogen dan penurunan atau hilangnya aktivitas gen onkosupresor.
Variasi kecil dan variasi struktural. Ini adalah dua jenis mutasi utama dalam genom. Varian kecil mengubah DNA dengan mengubah, menghapus, atau menambahkan sejumlah kecil basa, termasuk penyisipan basa, delesi, pergeseran kerangka, kehilangan kodon awal, mutasi kehilangan kodon henti, dll. Variasi struktural adalah penataan ulang genom yang besar, yang melibatkan segmen gen dengan ukuran mulai dari beberapa ribu basa hingga sebagian besar kromosom, termasuk perubahan jumlah salinan gen, delesi kromosom, duplikasi, inversi, atau translokasi. Mutasi ini dapat menyebabkan penurunan atau peningkatan fungsi protein. Selain perubahan pada tingkat gen individu, tanda genom juga merupakan bagian dari laporan sekuensing klinis. Tanda genom dapat dilihat sebagai pola kompleks dari variasi kecil dan/atau struktural, termasuk beban mutasi tumor (TMB), ketidakstabilan mikrosatelit (MSI), dan cacat rekombinasi homolog.

Mutasi klonal dan mutasi subklonal. Mutasi klonal terdapat pada semua sel tumor, terdapat pada saat diagnosis, dan tetap ada setelah pengobatan berlanjut. Oleh karena itu, mutasi klonal berpotensi digunakan sebagai target terapi tumor. Mutasi subklonal hanya terdapat pada sebagian kecil sel kanker dan dapat dideteksi pada awal diagnosis, tetapi menghilang seiring kekambuhan atau baru muncul setelah pengobatan. Heterogenitas kanker mengacu pada keberadaan beberapa mutasi subklonal pada satu kanker. Perlu dicatat, sebagian besar mutasi pemicu yang signifikan secara klinis pada semua spesies kanker umum adalah mutasi klonal dan tetap stabil selama perkembangan kanker. Resistensi, yang seringkali dimediasi oleh subklon, mungkin tidak terdeteksi pada saat diagnosis, tetapi muncul ketika kambuh setelah pengobatan.

Teknik tradisional FISH atau kariotipe sel digunakan untuk mendeteksi perubahan pada tingkat kromosom. FISH dapat digunakan untuk mendeteksi fusi, delesi, dan amplifikasi gen, dan dianggap sebagai "standar emas" untuk mendeteksi varian tersebut, dengan akurasi dan sensitivitas tinggi tetapi throughput terbatas. Pada beberapa keganasan hematologi, terutama leukemia akut, kariotipe masih digunakan untuk memandu diagnosis dan prognosis, tetapi teknik ini secara bertahap digantikan oleh uji molekuler tertarget seperti FISH, WGS, dan NGS.
Perubahan pada gen individu dapat dideteksi melalui PCR, baik PCR waktu nyata (real-time PCR) maupun PCR tetes digital (digital drop PCR). Teknik-teknik ini memiliki sensitivitas tinggi, khususnya cocok untuk mendeteksi dan memantau lesi residual kecil, dan dapat memperoleh hasil dalam waktu yang relatif singkat. Kelemahannya adalah jangkauan deteksinya terbatas (biasanya hanya mendeteksi mutasi pada satu atau beberapa gen), dan kemampuan untuk melakukan beberapa tes terbatas.
Imunohistokimia (IHC) adalah alat pemantauan berbasis protein yang umum digunakan untuk mendeteksi ekspresi biomarker seperti ERBB2 (HER2) dan reseptor estrogen. IHC juga dapat digunakan untuk mendeteksi protein bermutasi spesifik (seperti BRAF V600E) dan fusi gen spesifik (seperti fusi ALK). Keunggulan IHC adalah dapat dengan mudah diintegrasikan ke dalam proses analisis jaringan rutin, sehingga dapat dikombinasikan dengan tes lain. Selain itu, IHC dapat memberikan informasi tentang lokalisasi protein subseluler. Kelemahannya adalah skalabilitas yang terbatas dan tuntutan organisasi yang tinggi.
Sekuensing generasi kedua (NGS) menggunakan teknik sekuensing paralel berthroughput tinggi untuk mendeteksi variasi pada tingkat DNA dan/atau RNA. Teknik ini dapat digunakan untuk mengurutkan seluruh genom (WGS) dan wilayah gen yang diinginkan. WGS menyediakan informasi mutasi genom yang paling komprehensif, tetapi terdapat banyak kendala dalam aplikasi klinisnya, termasuk kebutuhan akan sampel jaringan tumor segar (WGS belum cocok untuk menganalisis sampel yang diimobilisasi formalin) dan biaya yang tinggi.
Pengurutan NGS yang ditargetkan mencakup pengurutan ekson utuh dan panel gen target. Tes ini memperkaya wilayah yang diinginkan dengan probe DNA atau amplifikasi PCR, sehingga membatasi jumlah pengurutan yang diperlukan (eksom utuh membentuk 1 hingga 2 persen genom, dan bahkan panel besar yang berisi 500 gen hanya membentuk 0,1 persen genom). Meskipun pengurutan ekson utuh berkinerja baik pada jaringan yang difiksasi formalin, biayanya tetap tinggi. Kombinasi gen target relatif ekonomis dan memungkinkan fleksibilitas dalam memilih gen yang akan diuji. Selain itu, DNA bebas yang bersirkulasi (cfDNA) muncul sebagai pilihan baru untuk analisis genom pasien kanker, yang dikenal sebagai biopsi cair. Baik sel kanker maupun sel normal dapat melepaskan DNA ke dalam aliran darah, dan DNA yang dilepaskan dari sel kanker disebut DNA tumor yang bersirkulasi (ctDNA), yang dapat dianalisis untuk mendeteksi potensi mutasi pada sel tumor.
Pemilihan tes bergantung pada masalah klinis spesifik yang ingin ditangani. Sebagian besar biomarker yang terkait dengan terapi yang disetujui dapat dideteksi dengan teknik FISH, IHC, dan PCR. Metode-metode ini cukup memadai untuk mendeteksi sejumlah kecil biomarker, tetapi tidak meningkatkan efisiensi deteksi dengan peningkatan throughput, dan jika terlalu banyak biomarker yang terdeteksi, mungkin tidak terdapat cukup jaringan untuk dideteksi. Pada beberapa kanker spesifik, seperti kanker paru-paru, di mana sampel jaringan sulit diperoleh dan terdapat banyak biomarker yang harus diuji, penggunaan NGS merupakan pilihan yang lebih baik. Kesimpulannya, pemilihan uji bergantung pada jumlah biomarker yang akan diuji untuk setiap pasien dan jumlah pasien yang akan diuji untuk biomarker tersebut. Dalam beberapa kasus, penggunaan IHC/FISH sudah memadai, terutama ketika target telah teridentifikasi, seperti deteksi reseptor estrogen, reseptor progesteron, dan ERBB2 pada pasien kanker payudara. Jika eksplorasi mutasi genom yang lebih komprehensif dan pencarian target terapi potensial diperlukan, NGS lebih terorganisir dan hemat biaya. Selain itu, NGS dapat dipertimbangkan dalam kasus di mana hasil IHC/FISH ambigu atau tidak meyakinkan.

Berbagai pedoman memberikan panduan tentang pasien mana yang memenuhi syarat untuk tes genetik. Pada tahun 2020, Kelompok Kerja Kedokteran Presisi ESMO mengeluarkan rekomendasi tes NGS pertama untuk pasien kanker stadium lanjut, yang merekomendasikan tes NGS rutin untuk sampel tumor kanker paru non-skuamosa non-sel kecil stadium lanjut, kanker prostat, kanker kolorektal, kanker saluran empedu, dan kanker ovarium. Pada tahun 2024, ESMO memperbaruinya berdasarkan hal ini, merekomendasikan inklusi kanker payudara dan tumor langka, seperti tumor stroma gastrointestinal, sarkoma, kanker tiroid, dan kanker yang tidak diketahui asalnya.
Pada tahun 2022, Opini Klinis ASCO tentang pengujian genom somatik pada pasien kanker metastasis atau stadium lanjut menyatakan bahwa jika terapi terkait biomarker disetujui pada pasien dengan tumor padat metastasis atau stadium lanjut, pengujian genetik direkomendasikan untuk pasien tersebut. Misalnya, pengujian genomik harus dilakukan pada pasien dengan melanoma metastasis untuk menyaring mutasi BRAF V600E, karena inhibitor RAF dan MEK disetujui untuk indikasi ini. Selain itu, pengujian genetik juga harus dilakukan jika terdapat penanda resistensi yang jelas terhadap obat yang akan diberikan kepada pasien. Egfrmab, misalnya, tidak efektif pada kanker kolorektal mutan KRAS. Ketika mempertimbangkan kesesuaian pasien untuk pengurutan gen, status fisik pasien, komorbiditas, dan stadium tumor harus diintegrasikan, karena serangkaian langkah yang diperlukan untuk pengurutan genom, termasuk persetujuan pasien, pemrosesan laboratorium, dan analisis hasil pengurutan, mengharuskan pasien memiliki kapasitas fisik dan harapan hidup yang memadai.
Selain mutasi somatik, beberapa kanker juga harus diuji untuk gen germline. Pengujian mutasi germline dapat memengaruhi keputusan pengobatan untuk kanker seperti mutasi BRCA1 dan BRCA2 pada kanker payudara, ovarium, prostat, dan pankreas. Mutasi germline juga dapat berimplikasi pada skrining dan pencegahan kanker di masa mendatang pada pasien. Pasien yang berpotensi cocok untuk pengujian mutasi germline perlu memenuhi persyaratan tertentu, yang melibatkan faktor-faktor seperti riwayat kanker keluarga, usia saat diagnosis, dan jenis kanker. Namun, banyak pasien (hingga 50%) yang membawa mutasi patogen pada germline tidak memenuhi kriteria tradisional untuk pengujian mutasi germline berdasarkan riwayat keluarga. Oleh karena itu, untuk memaksimalkan identifikasi pembawa mutasi, National Comprehensive Cancer Network (NCCN) merekomendasikan agar semua atau sebagian besar pasien dengan kanker payudara, ovarium, endometrium, pankreas, kolorektal, atau prostat diuji untuk mutasi germline.
Mengenai waktu pengujian genetik, karena sebagian besar mutasi pemicu yang signifikan secara klinis bersifat klonal dan relatif stabil selama perkembangan kanker, pengujian genetik pada pasien saat diagnosis kanker stadium lanjut adalah wajar. Untuk pengujian genetik selanjutnya, terutama setelah terapi target molekuler, pengujian ctDNA lebih menguntungkan daripada DNA jaringan tumor, karena DNA darah dapat mengandung DNA dari semua lesi tumor, yang lebih kondusif untuk memperoleh informasi tentang heterogenitas tumor.
Analisis ctDNA setelah perawatan mungkin dapat memprediksi respons tumor terhadap perawatan dan mengidentifikasi perkembangan penyakit lebih awal dibandingkan metode pencitraan standar. Namun, protokol penggunaan data ini untuk memandu keputusan perawatan belum ditetapkan, dan analisis ctDNA tidak direkomendasikan kecuali dalam uji klinis. ctDNA juga dapat digunakan untuk menilai lesi residual kecil setelah operasi tumor radikal. Pengujian ctDNA setelah operasi merupakan prediktor kuat perkembangan penyakit selanjutnya dan dapat membantu menentukan apakah pasien akan mendapatkan manfaat dari kemoterapi adjuvan. Namun, penggunaan ctDNA di luar uji klinis untuk memandu keputusan kemoterapi adjuvan masih belum direkomendasikan.

Pemrosesan data. Langkah pertama dalam pengurutan genom adalah mengekstraksi DNA dari sampel pasien, menyiapkan pustaka, dan menghasilkan data pengurutan mentah. Data mentah ini memerlukan pemrosesan lebih lanjut, termasuk menyaring data berkualitas rendah, membandingkannya dengan genom referensi, mengidentifikasi berbagai jenis mutasi melalui berbagai algoritma analitik, menentukan efek mutasi ini terhadap translasi protein, dan menyaring mutasi germline.
Anotasi gen penggerak dirancang untuk membedakan mutasi penggerak dan penumpang. Mutasi penggerak menyebabkan hilangnya atau peningkatan aktivitas gen penekan tumor. Varian kecil yang menyebabkan inaktivasi gen penekan tumor meliputi mutasi nonsense, mutasi frameshift, dan mutasi situs penyambungan kunci, serta delesi kodon start yang lebih jarang, delesi kodon stop, dan berbagai macam mutasi penyisipan/delesi intron. Selain itu, mutasi missense dan mutasi penyisipan/delesi intron kecil juga dapat menyebabkan hilangnya aktivitas gen penekan tumor ketika memengaruhi domain fungsional penting. Varian struktural yang menyebabkan hilangnya aktivitas gen penekan tumor meliputi delesi gen parsial atau komplet dan varian genomik lainnya yang menyebabkan kerusakan kerangka pembaca gen. Varian kecil yang menyebabkan peningkatan fungsi onkogen meliputi mutasi missense dan penyisipan/delesi intron sesekali yang menargetkan domain fungsional protein penting. Dalam kasus yang jarang terjadi, pemotongan protein atau mutasi situs penyambungan dapat menyebabkan aktivasi onkogen. Variasi struktural yang menyebabkan aktivasi onkogen meliputi fusi gen, penghapusan gen, dan duplikasi gen.
Interpretasi klinis variasi genomik menilai signifikansi klinis dari mutasi yang teridentifikasi, yaitu potensi nilai diagnostik, prognostik, atau terapeutiknya. Terdapat beberapa sistem penilaian berbasis bukti yang dapat digunakan untuk memandu interpretasi klinis variasi genomik.
Basis Data Onkologi Kedokteran Presisi (OncoKB) dari Memorial Sloan-Kettering Cancer Center mengklasifikasikan varian gen ke dalam empat tingkatan berdasarkan nilai prediktifnya terhadap penggunaan obat: Tingkat 1/2, biomarker yang disetujui FDA, atau berstandar klinis yang memprediksi respons indikasi spesifik terhadap obat yang disetujui; Tingkat 3, biomarker yang disetujui atau tidak disetujui FDA yang memprediksi respons terhadap obat target baru yang telah menunjukkan hasil positif dalam uji klinis, dan Tingkat 4, biomarker yang tidak disetujui FDA yang memprediksi respons terhadap obat target baru yang telah menunjukkan bukti biologis yang meyakinkan dalam uji klinis. Subkelompok kelima yang terkait dengan resistensi pengobatan telah ditambahkan.
Pedoman American Society for Molecular Pathology (AMP)/American Society of Clinical Oncology (ASCO)/College of American Pathologists (CAP) untuk interpretasi variasi somatik membagi variasi somatik menjadi empat kategori: Derajat I, dengan signifikansi klinis yang kuat; Derajat II, dengan potensi signifikansi klinis; Derajat III, signifikansi klinis tidak diketahui; Derajat IV, tidak diketahui signifikansi klinisnya. Hanya varian derajat I dan II yang penting untuk keputusan pengobatan.
Skala Operabilitas Klinis Target Molekuler (ESCAT) ESMO mengklasifikasikan varian gen ke dalam enam tingkat: Tingkat I, target yang sesuai untuk penggunaan rutin; Tahap II, target yang masih dalam tahap studi, kemungkinan akan digunakan untuk menyaring populasi pasien yang dapat memperoleh manfaat dari obat target, tetapi diperlukan lebih banyak data untuk mendukungnya. Tingkat III, varian gen target yang telah menunjukkan manfaat klinis pada spesies kanker lain; Tingkat IV, hanya varian gen target yang didukung oleh bukti praklinis; Pada tingkat V, terdapat bukti yang mendukung signifikansi klinis dari penargetan mutasi, tetapi terapi obat tunggal terhadap target tidak memperpanjang kelangsungan hidup, atau strategi pengobatan kombinasi dapat diadopsi; Tingkat X, kurangnya nilai klinis.